Savremene tehnike oslikavanja u dijagnostici u većoj meri baziraju se na nuklearnoj magnetnoj rezonanci (eng. „magnetic resonance imaging“ – MRI). Pregled kliničkih studija u oblasti neurologije ukazuje na generalno odsustvo pouzdanaih ćelijskih i molekulskih biomarkera. U cilju efikasnijeg ispitivanja patologije koriste se ćelijski i animalni modeli bolesti i komplementarne tehnike. U tom cilju, koristeći se MRI-tehnikama in vivo, kao i elektrofiziološkim i imunocitofluorescentnim merenjima na izolovanim ćelijama i tkivima ispitivali smo neurodegenerativno oboljenje motoneurona amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS) na eksperimentalnom modelu hSOD1^G93A pacova (nosi multiple kopije humane mutacije za superoksid dismutazu 1). ALS je najčešći oblik primarne forme progresivne motoneuronske bolesti. Transgeni miš ili pacov hSOD1^G93A ima ALS-fenotip. Nedavno je upravo na ovom animalnom modelu pokazano da CD4+ tip T-limfocita ima ključnu ulogu u neuroprotekciji i supresiji neuroinflamatornih procesa.

Dobijeni MRI rezulati proveravani su na moždanim isečcima tehnikom imunofluorescencije. U svrhu registrovanja imunofluorescencije korišćen je konfokalni laserski skanirajući mikroskop „LSM 510“, proizvođača „Carl Zeiss GmbH“ sa tri laserske jedinice: Ar multilinijski (457, 478, 488 i 514 nm) i dva He-Ne lasera (543, odn. 633 nm). Ovaj laserski sklop omogućuje ekscitaciju posebnih fluorohroma (fluorescentnih indikatora). Dvokanalno registrovanje emitovanog svetla je u opsegu od 475 nm preko zelenog i crvenog dela vidljivog spektra do IC svetla. Fluorescentnim obeležavanjem ispitivani su biomarkeri limfocita (TCR), mikroglije (OX-42 i ED-1) i neurona (NeuroTrace i NeuN). U cilju boljeg sagledavanja interakcije ćelija vršena je i akvizicija serije optičkih preseka uzorka pomoću z-filtera i potom rekonstrukcija 3D slike pomoću projekcionog „Zeiss“ računarskog programa.

Elektorfiziološkim tehnikama na neuronima u kulturi pokazano je da imunoglobulini seruma pacijenata dovode do strujne aktivacije presinaptičkog porekla. MRI na hSOD1^G93A pacovu in vivo otkrio je presimtomatične markere lezija u motornim jedrima kao i dilatirane moždane komore. Takodje, upotrebom posebnih magnetnih kontrasta i paramagnetnih nano-obeleživača utvrdjene su i tačke propustljivosti krvno-moždane barijere i infiltracija CD4+ i CD8+ limfocita. Konfokalnom mikroskopijom pokazani su reaktivni astrociti u okolini dilatiranih komora (MRI-nalaz), kao i aktivacija mikroglije u hipokampusu i moždanom stablu. Uočena je i interakcija mikroglije i neurona tj. kolokalizacija njihovih fluorescentnih markera. Najzad, dinamičkim merenjem mobilnosti fluorescentno obeleženih lizozoma astroglijalnih ćelija utvrdjen je efekat imunoglobulna ALS pacijenata na povećanje parametara mobilnosti ovih intraćeliskih vezikula.

Seminar

Pavle Andjus